어류의 성분화

1990년 사람의 성 결정유전자가 SRY가 발견된 이후 이 유전자의 유무에 의해 유도되어지는 것으로 생각되는 생식선이나 뇌의 성 분화 과정에 관하여 주로 마우스를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 SRY의 상·하부에 작용하는 성 분화의 유전자 cascade는 아직도 알려지지 않았다. 또한 조류, 파충류, 양서류, 어류에 있어서도 성은 수정시 성염색체의 조합에 의해 유전적으로 결정되는 경우가 일반적이다. 그러나 이러한 동물에서는 SRY의 상동 유전자가 아직도 발견되지 않고 있다.

또한 파충류에서는 성염색체의 존재가 아직 확인되지 않은 종도 적지 않은데, 이러한 경우 성 결정기구는 부란의 환경, 특히 온도에 의존하는 경우가 많다. 비슷한 수온 의존적 성 결정 기구가 어류에도 있는데, 예를 들어 광어 등이 알려져 있다.

이와 같이 포유류 이외의 척추동물의 성 결정기구에 관해 아직도 알려지지 않은 것이 많아 금후의 연구에 많은 기대를 걸 수밖에 없는 실정이다.

한편 이 심포지움의 주제이기도 한 성 분화의 기구에 관해서는 어류에서 조류까지 “생식선의 성 분화는 성호르몬이 중심적인 역할을 한다”는 것이 과학자들간의 일치된 의견이다. 포유류에서는 이제까지 생식선의 성 분화제어에 있어서 성호르몬의 중요성이 특별히 제시되지 않았는데 이러한 점이 포유류와 이외의 척추동물과 크게 다르다.

우리들은 성호르몬이 성 분화과정 조절에 깊게 관여하고 있는 것으로 알려진 어류에 주목하여 포유류를 대상으로 한 연구와 다른 접근방법으로 성 결정 및 분화에 대한 연구를 진행하고 있다. 생식선의 성 분화 연구에 어류를 이용하므로서 얻는 최대의 이점은 성호르몬이 이 과정에서 중요한 역할을 하는 것을 보여주는 실험적 증거가 많이 축적되어 있으며, 산호초 등에 서식하는 놀래기 등에서 보여지는 것처럼 성체에서의 기능적 성전환 또는 웅성 성숙, 자성 성숙, 암수 동체 등 실제적으로 여러가지의 암수 성에 관한 현상이 어류에는 존재한다는 것이다. 우리들은 어류를 실험대상으로 생식선의 성 분화 제어기구를 세포 분자 수준에서 밝히고자 연구를 수행하였다. 여기서는 주로 틸라피아(Oreochromis nilticus)에 관한 최근까지의 연구에 관해 소개하고자 하며, 송사리와 성전환어(하와이산 놀래기) 등을 이용한 연구에 관해서도 이야기하고자 한다.

전부 암컷 또는전부 수컷인 물고기 제작

어류에서 보여지는 성호르몬의 성전환작용을 이용하여 몇종의 어류에서 유전적으로 물고기를 전부 암컷 또는 수컷으로 만드는 방법이 개발되고 있다. 여기서 우리가 사용하고 있는 틸라피아의 암수 분별 제작을 소개한다.

먼저 전부 암컷인 물고기는 정상의 수컷(XX)에서 얻어진 알을 안드로젠으로 성전환시킨 가짜 수컷(XX)의 정자로 수정시켜 비교적 용이하게 얻어질 수 있다. 한편 전부 수컷인 물고기의 생산은 다소 어려움이 있는데, 먼저 제1단계로 정상의 수컷(XY)를 에스트로젠 처리에 의해 성전환시킨 가짜 수컷을 만들 필요가 있다. 다음에 이 가짜 수컷의 알을 정상 수컷(XY)의 정자와 수정시켜 얻어진 것 중에서 招수컷(YY)을 선별하여 이것을 정상적인 수컷(XY)과 교배하면 전부 수컷인 물고기를 얻을 수 있다. 우리 실험실에서도 틸라피아를 26℃에서 사육하고 있는데, 이러한 조건에서는 거의 2주마다 배란, 산란을 반복한다. 그리고 몇마리의 암컷(XX)과 招수컷(YY)을 확보하고 있다면 언제라도 유전적으로 암 또는 수 물고기를 얻을 수 있어 생식선의 성 분화기구의 연구를 행하는 데는 좋은 실험재료로 생각한다.

 생식선의 성 분화

어류 생식선의 성 분화과정에서는 난소로 분화하는 것이 정소로 분화하는 것보다 먼저 일어나는 것이 일반적이다. 틸라피아에서는 부화 후 10~20일에 일어나는 체세포의 분화가 최초의 형태적 지표가 된다. 이 시기의 암컷에서는 생식선의 배측 또는 복측의 경계를 따라 체세포의 집계가 생기고 그것이 양측으로 신장하면서 융합하여 체측 복벽에 소강(小腔)이 형성된다. 이 곳은 장래에 성숙한 알이 배란되는 난소강이 되는 곳으로 이 난소강의 형성이 난소분화로의 형태적 특징이 된다. 부화 후 30~35일에는 난원세포가 증식하여 감수분열 전기로 이행되어 난 형성을 시작한다. 한편 수컷의 생식선에서는 부화후 20~25일째 장관막에 접한 부분의 체시포 조직 중에 수정관원기를 형성하는 세포군이 분화하여 정소분화가 확실히 관찰된다. 그 후 정원세포는 증식하여 부화 후 70일에 새로이 형성된 cyst 중에서 감수분열을 시작한다.

생식세포

어류 생식세포의 기원은 아직 알려지지 않고 있다. 그러나 최근 생식세포의 marker 유전자인 vasa 유전자가 어류의 생식선에서도 cloning되어 이 유전자의 발현을 지표로 생식세포의 기원을 밝히려 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이 vasa는 초파리에서 최초로 발견된 유전자로 생식세포의 전구체인 극세포의 분화에 필요한 것으로 알려져 있다. 이 vasa에 상동한 zebra fish의 유전자가 vas는 mRNA로서 수정란 시기부터 존재하여 2세포기에서는 제1난활면상의 양단 가까운 위치 2개소에 존재하여 4세포기에는 이 곳 외에 제2활면상의 양단에 가까운 2개소 등 총 4개소에 존재한다. 이 vas 양성세포는 400 세포기가 되면 천천히 증가하기 시작하여 이동하여 원시생식세포가 된다.

틸라피아에서도 vas가 cloning되어 특이항체가 만들어졌다. 유전적 암·수 모두 vas 양성세포는 부화당일에는 이미 장관 주위의 측판 중 배엽의 외측에 관찰되어 부화 후 3일째에는 생식성 원기에 도달한다. 이 사이에 원시생식세포의 이동과정에서는 암수차가 보이지 않는다. 그 후 유전적으로 암컷인 생식선에서는 부화 후 15일 후 생식세포수의 증가가 보여져 35일 후에 약 3000개의 난원세포가 된다. 한편 동 시기의 유전적 수컷의 생식선에서의 정원세포수에는 큰 변화는 없다(그림 2). 우리들은 최근 형광표식한 vas 유전자를 이용하여 `반짝이는 생식세포'를 가진 transgenic 개체를 세계에서 최초로 송사리에서 만들었다. 이 유전자 도입 송사리를 이용하면 생식세포의 이동 형태 및 생식선의 성 분화과정을 살아있는 그대로 관찰할 수 있으며 생식세포나 생식선의 발생, 분화기구를 해석하기 위해서는 유익할 것으로 생각된다. 더욱이 내분비계 장애물질 등의 생식 계통에 대한 영향을 조사하기 위한 모델동물로서 공헌할 것으로 크게 기대된다.

성호르몬(스테로이드)

어류에서는 배우자형성 각 과정에 관련된 성호르몬의 종류가 정해져 있다. 또한 이러한 성호르몬이 생식선 자극 호르몬(FSH, LH)의 작용에 의해 난소와 정소의 체세포에서 생성되어지는 과정이 상세하게 설명되고 있다. 연어과 어류 등을 이용하여 이제까지 단리, 동정한 주요한 성호르몬은 11 -ketotestosterone(정자형성 유도호르몬), 에스트라디올 17β(난황형성 유도호르몬), 17α, 20β dihydoxy -4 -pregnen -3 -on(난^정자성숙 유도호르몬)의 3종이다(그림 3). 이하에 언급한 것과 같이 이중에 성 분화기 이전의 생식선으로부터 분비되어 난소의 분화 및 구축에 중심적인 역할을 하는 것으로 생각되어지는 성호르몬은 에스트로젠(에스트라디올 17β)이다.

성호르몬 처리에 의해 어류의 성전환을 일으키는 것은 알려져 있다. 그러나 성호르몬 처리시 성전환이 언제나 일어나는 것은 아니고 그것이 가능한 시기는 부화직후부터 성 분화직전까지 아주 짧은 시간으로 한정되어 있다. 이 시기는 소위 `창(narrow window)'으로 불리우는 시기로 생식선이 성호르몬에 대해 높은 감수성을 보이는 특이적인 시기이다. 따라서 먼저 이 시기의 생식선에 있어서 성호르몬환경을 상세히 해석할 필요가 있다. 그러나, 전체 길이가 0.5㎜에도 미치지 못하는 어린 물고기의 생식선이나 혈중의 성호르몬량을 측정하는 것은 어렵다. 여기서 에스트로젠과 안드로젠의 합성에 관여하고 있는 스테로이드호르몬 대사효소의 발현을 유전자와 단백질 수준에서 조사하였다. 부화후 10일째의 유전적 암컷의 생식선에서 에스트로젠 생성에 필요한 방향화효소를 포함한 모든 스테로이드대사효소의 유전자와 단백질이 발현하고 있는 것을 알아냈다. 이 시기에는 또한 에스트로젠이 이미 생성·분비되고 있는 것으로 사료되고, 성 분화 이전의 암컷(XX)을 방향화효소저해제(fadrozol)로 처리한 경우 에스트로젠합성을 억제하므로서 이 개체는 성전환하여 수컷이 되어 정소가 형성된다. 따라서 난소의 형성에는 에스트로젠이 필요하다. 한편 성 분화전후의 수컷 생식선에서는 스테로이드 대사효소의 발현은 보이지 않아 성호르몬은 생산되지 않는 것으로 생각된다.

에스트로젠이 난소 유지에 중요한 역할을 하는 것을 보여주는 예로서, 성전환어에 관해서 간단히 언급하려 한다.

어떤 종의 하와이산 놀래기의 암컷은 전체 길이가 12.5cm 정도 되면 자연조건하에서 성전환하여 수컷(2차 수컷)이 된다. 물론 태어날 때부터의 수컷(1차 수컷)도 있다. 이와 같이 성전환을 수조내에서도 실험적으로 유발시킬 수 있다. 크기가 다른 몇 마리의 암컷을 한 수조내에 사육하면 1개월 정도 지나면 제일 큰 암컷이 수컷으로 성전환한다. 실험 개시후 곧 제일 큰 암컷의 난소에서 큰 알이 소실되기 시작하여 난소전체가 퇴화하는 동시에 생식선 주위에 정원세포가 출현하여 서서히 완전한 정소가 형성되어진다. 성전환이 일어나기 전의 난소에서는 방향화효소유전자의 발현이 강하게 나타나며 에스트로젠이 다량 생산된다. 한편 성전환이 일어나는 조건에 놓여진 암컷에서는 즉시 방향화효소유전자이 발현이 억제되어 에스트로젠의 분비가 급격히 감소한다. 이 결과로 난포가 소실되어 구조적으로는 암수의 구별이 되지 않는 생식선이 된다. 그러나 이러한 상태가 길게 지속되지 않고 곧 합성되는 안드로젠(11-keto\ testosterone)의 작용에 의해 정자형성이 시작되어 성숙한 정소가 된다. 이와 같이 하와이산 놀래기의 암컷(난소)에서 수컷(정소)으로의 성전환은 난소에서의 에스트로젠 합성능의 급격한 저하가 원인이 되어 일어난다. 이러한 예와 같이 난소의 분화^유지에 에스트로젠이 중요한 역할을 하는 것이 밝혀졌다.

성호르몬 수용체

성호르몬 작용은 표적세포 세포질 또는 핵내 성호르몬 수용체에 의해 중개된다. 틸라피아 성어의 난소에는 포유류와 같이 2종류의 에스트로젠수용체(ERα 와 ERβ )유전자가 발현하고 있다. 성 분화와 관련하여 흥미깊은 것은 이 2종류의 수용체 유전자가 성 분화가 일어나기 전의 XX 암컷, XY 수컷의 생식선에 발현하고 있다는 것이다. 유전적 암컷의 생식선에 보여지는 에스트로젠수용체의 발현은 성 분화전 XY 수컷을 외인성 에스트로젠으로 처리하면 성전환이 일어나 정상적인 난소가 형성된다. 또한 유전적인 암컷에서 난소가 형성되어지는 과정에서 ERα 와 ERβ 의 발현 pattern의 차이를 조사한 결과, ERα 는 난소강의 형성에 또한 ERβ 는 난원세포의 증식 등에 중요한 역할을 하는 것이 시사된다. 2종류의 ER에 보여진 이와 같은 기능의 차이는 tamoxifen(ER antagonist)를 이용한 에스트로젠 수용체의 기능 저해실험에서도 보여진다. 이러한 수용체는 아마도 다른 표적세포를 가지고 있으며 증식인자 등의 작용에 의해 다른 작용을 발휘하는 것으로 생각된다. 이후 성 분화기의 암컷 생식선에 발현하는 ER 표적유전자에 관하여 상세히 분석할 필요가 있다.

최근 우리는 2종류의 안드로젠수용체(ARα 와 ARβ )유전자를 척추동물에서 처음으로 분리하였다. 예상과 달리 이 안드로젠수용체는 유전적인 암컷의 성 분화 전기 생식선에서는 이미 발현하고 있으나, 같은 시기의 유전적 수컷의 생식선에서는 명확히 발현되지 않았다. 앞에서 언급한 바와 같이 안드로젠합성효소의 결여와 마찬가지로 성호르몬은 정소의 분화^구축과 관련하여 필수적인 것은 아닐지도 모른다.

Ad4BP/SF -1, Sox -9

성 분화기 전후의 포유류 생식선에 발현하는 유전자의 대부분이 같은 시기의 어류 생식선에도 발현하고 있으나, 그 중에 Ad4BP/SF -1과 Sox -9 유전자에 대해 언급하려고 한다.

앞에서 언급한 바와 같이, 암컷 생식선의 난소분화는 에스트로젠 합성효소, 특히 방향화효소의 성, 시기, 세포특이적 발현에 의해 제어되는 것으로 생각되어, 송사리와 틸라피아의 난소에서 방향화효소 유전자의 전사제어인자의 하나인 Ad4BP/SF -1 유전자를 분리하였다. 2종 모두 성어에서는 Ad\ 4BP/SF -1의 발현이 생식선과 間腎조직 등의 스테로이드 생산세포에 한정되어 있으며, 특히 난황형성기 난포 과립막세포에 발현되는 방향화효소유전자의 전사인자로서의 작용은 난형성에 중요한 것으로 밝혀졌다.

한편 부화 직후의 생식선에서 Ad4\ BP/SF -1가 최초로 검출되는 곳은 복측부 비스테로이드 생산성 체세포로 원시생식세포가 생식선 원기에 도달하는 시기와 일치한다. 그 후 Ad4BP/SF -1는 암컷 생식선의 스테로이드 생산세포에서도 검출되게 되지만 최초 발현은 스테로이드 대사효소유전자의 발현과 거의 동시기에 일어난다. 따라서 Ad4BP/SF -1는 스테로이드 생산세포의 분화 및 기능을 조절하는 것 뿐만 아니라 생식선의 구축 그 자체에도 깊게 관련되어 있다고 생각되어진다.

Sox -9 유전자는 암·수 관계없이 부화 후 5일째의 생식선 stroma세포에서 처음 발현한다. 암수의 성차는 부화 후 15일경부터 인정되며 유전적 암컷에서는 stroma 세포 및 생식세포주변의 체세포 이외에 이후 난소강 형성에 관계되는 상피세포에서도 강하게 발현된다. 난소에서의 Sox -9의 발현은 부화후 30일경까지 계속되지만, 그 후 서서히 감소한다. 한편 유전적 수컷에서의 발현은 정소형성 후 Sertoli cell과 수정과 원기세포에서 특히 강하게 발현되며 그 발현량 증가가 정세관 구조의 발달과 병행하였다. 이와 같은 수정관 상피세포에서의 Sox -9의 발현은 세정관구조의 완성시 감소하지만 Sertoli 세포에서의 발현은 그대로 유지된다. 

DMT, DMO

지금까지 기술한대로 유전적 암컷 틸라피아의 생식선에서는 난소가 형성되기 10일 이상 전부터 에스트로젠 합성에 필요한 스테로이드 대사효소 전부가 합성되어지는 것으로 생각되어진다. 그러나 유전적 수컷의 성 분화 전·후 생식선에 특이적으로 발현하는 유전자는 발견되지 않았다. 여기서 우리들은 초파리(Doublesex)와 선충(Mab -3)의 성 결정, 분화에 관한 유전자의 공통적인 배열(DM domain)을 probe로 하여 틸라피아의 정소와 난소에서 각각 특이적인 발현을 보이는 DMT(DM domain gene in testis), DMO(DM domain gene in ovary)를 cloning하였다. 이 중에 DMT는 성 분화전 유전적인 수컷의 생식선 체세포에서 이미 발현되었으며, 정소형성 후에는 Sertoli 세포와 수정관 상피세포에서 강하게 발현한다.

한편 DMO는 난황형성초기의 난모세포에 강하게 발현한다. 이와 같이 DMT는 유전적 수컷 생식선 체세포에서 특이적인 발현을 보이므로 정소분화에 중요한 역할을 하는 것으로 추측되어지고 있다. 또한 CMO는 난모세포에서의 발현 패턴을 보이므로 난형성의 초기과정에 관여하고 있을 가능성이 높다.

성 결정유전자

어류에서도 Y 염색체상에 정소를 결정하는 유전자가 존재하는 것으로 생각되어지고 있어, 틸라피아에서도 Y 염색체상의 어떤 유전자 정보가 유전적 수컷개체에서 생식선의 성 분화에 중요한 역할을 하고 있을 가능성이 높다. 특히 성 분화 전의 XY개체 생식선에서 안드로젠/안드로젠수용체계의 발현이 억제되는 것과의 관련성이 주목받고 있다. 또한 이 시기에 정소의 체세포에 특이적으로 발현하는 DMT와의 관련도 흥미롭다.

성 결정유전자의 발현에서 정소분화에 이르는 유전자 cascade를 밝히는 것이 생식선의 성 분화제어기구를 해명하기 위해 중요하다고 생각된다. 따라서 우리는 니이가타대학과 공동으로 송사리에서 이러한 성 결정 유전자를 positional cloning에 의해 단리하는 project를 시작하였다. 성 결정유전자를 이 방법으로 단리하기 위해서는 먼저 성에 관련한 marker의 단리와 큰 insert sizw를 가진 genome library가 필요하다. 이 점에서 송사리에서는 유전적 배경이 다른 근교계간의 교배가 가능하기 때문에 한 계통의 유전적인 배경을 가진 송사리에 다른 계통의 Y 염색체를 가진 Y congenic 송사리를 만드는 것이 가능하다. 이 Y conge\ nic 개체를 이용함으로서 성에 연쇄되어 있는 DNA marker를 효율적으로 단리할 수 있다. 그리고 이 congenic 송사리의 genome에서 세균인공염색체(BAC) library를 구축하는 것이 가능하므로 BAC clone 작성 시에 X 성염색체와 Y 성염색체를 용이하게 판별하는 것이 가능하게 되었다. 현재 성 결정유전자를 사이에 둔 DNA marker를 개시점으로 쌍방에서 성 결정유전자 쪽으로 염색체조사를 시행하고 있다. 가까운 미래에 송사리의 성 결정 유전자가 단리되어 그 유전자구조가 해명되는 것을 기대하고 있다.

결론 및 향후 전망

그림 4에 어류의 성 결정, 분화의 과정과 이것에 영향을 미치는 것으로 생각되어지는 성호르몬/성호르몬수용체계, 각각의 제어유전자, 환경요인 등을 정리하였다. 여기서의 중요한 것은 유전적 암컷 개체에서 난소의 분화에 에스트로젠/에스투로젠 수용체 sys\ tem이 중심적 역할을 한다는 것이다. 향후에는 방향화 효소를 비롯한 에스트로젠합성에 관련된 스테로이드 대사효소가 유전적인 암컷의 생식선에서 성, 시기, 세포특이적으로 생성되는 과정을 상세히 해석할 필요가 있다. 현재 특히 방향화효소 유전자의 전사제어기구를 조사하고 있다. 또한 에스트로젠으로 유도되어진 난소분화의 기전에 관해 틸라피아 성적 미분화 생식선의 기관배양계를 이용하여 해석하고 있다.

한편 유전적 수컷에서는 성 분화 전기에 안드로젠/안드로젠수용체 system이 불활성으로 작동하는 상태가 아닌 것으로 추측된다. 그러면 왜 이 시기의 유전적 수컷은 생식선에서는 성호르몬이 만들어지지 않는 것인가?

이 의문을 풀 수 있는 열쇠는 Y 염색체상의 성 결정유전자 및 정소 체세포에서 특이적인 발현을 보이는 DMT 유전자에 있는 것으로 생각되어진다. 특히 이 2개의 유전자는 성 결정, 분화의 유전자 cascade의 어딘가에서 상호 연결될 가능성이 높고 이러한 관점에서의 연구가 진행되고 있다.

생식선의 성 분화기구에 관한 기초 지식의 축적은 내분비계 장애물질의 작용기전을 밝히기 위해 필요불가결하다. 오염된 수역에서 서식하는 물고기에 종종 보여지는 암수동체(난소 및 정소를 동시에 가짐) 등의 생식선 이상 중에는 부화직후 호르몬감수성이 높은 시기(창, narrow window)에 유해화학물질에 노출된 것이 원인이 되는 경우도 충분히 생각해 볼 수 있다. 여기서 조금 언급하였지만, 어류에서는 척추·무척추동물을 통틀어 유일하게 배우자의 형성 또는 성숙의 모든 과정을 제어하는 생식선자극 호르몬/성호르몬계가 거의 완전히 동정되어 있다. 성 분화기를 포함한 모든 과정에 미치는 내분비계 장애물질의 영향을 하나하나 상세히 검색하여 각각의 작용기전을 밝히는 것이 필요하다. 여기서 언급한 어류의 실험계는 척추동물의 생식계에 미치는 내분비계 장애물질의 영향을 분자세포수준으로 해석하기 위한 우수한 연구모델이 될 것이다.